Kỹ thuật AFLP
AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen. Sự khác nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt.Nguyên lý:
- RE sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt thường xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thường xuyên
- Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI – MseI.
- Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase.
- Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide.
- Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại,
AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn bộ gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài (các mồi thương mại có thể dùng cho hầu hết các loài). Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp.
Các bước thực hiện
1. Cắt ADN hệ gen với 2 restriction enzymes ( EcoRI , Msel)
2. Gắn với adaptor đã biết trình tự
3. Chạy PCR sử dụng mồi thiết kế bổ sung với các adaptor+1 base sai khác ở đầu 3' của mồi
4. Nhân chọn lọc sủ dụng mồi bổ sung với adaptor(+1bp)+2 bp tùy ý
5. Nhận biết sản phẩm bằng radioactive dNTPs trong các bước của PCR hoặc các mồi được đánh dấu huỳnh quang
2. Gắn với adaptor đã biết trình tự
3. Chạy PCR sử dụng mồi thiết kế bổ sung với các adaptor+1 base sai khác ở đầu 3' của mồi
4. Nhân chọn lọc sủ dụng mồi bổ sung với adaptor(+1bp)+2 bp tùy ý
5. Nhận biết sản phẩm bằng radioactive dNTPs trong các bước của PCR hoặc các mồi được đánh dấu huỳnh quang
Ứng dụng
Đánh giá đa dạng di truyền
- Phân tích độ dài di truyền
- Kiểm tra dấu hiệu di truyền
- Phân tích bộ sưu tập nguồn gene (germplasm collections)
- Xây dựng bản đồ gene
- Quản lý các chỉ thị thăm dò
==>>Các bạn xem video để rõ thêm nhé :v