Western Blot là một kỹ thuật phân tích được sử dụng rộng rãi nhằm phát hiện các protein chuyên biệt trên các mẫu mô hay dịch chiết xuất mô.
1. Nguyên lý
Western Blot là kỹ thuật lai giữa protein với protein (Kháng nguyên – Kháng thể). Protein kháng nguyên được phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang
2. Các bước thực hiện:
Bước 1: Xử lý mẫu
Lấy mẫu từ toàn bộ mô hay môi trường nuôi cấy tế bào. Đầu tiên, xử lý mô rắn bằng phương pháp cơ học . Những mẫu virus hay mẫu lấy trừ trong môi trường nuôi cấy cũng có thể là nguồn protein xác định được trong Western Blot. Thêm các loại chất tẩy rửa, muối và dung dịch đệm để ly giải tế bào và hòa tan protein
Bước 2: Điện di trên gel
Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa trên điểm đẳng điện, khối lượng phân tử, điện tích hoặc phối hợp các yếu tố trên.
Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai
Để các protein có thể phát hiện được kháng thể thì protein phải được chuyển từ gel lên màng lai. Phương pháp chính để chuyển các protein được gọi là phương pháp thẩm tách điện là sử dụng một dòng điện để kéo các protein từ gel lên màng PVDF hoặc màng nitrocellulose. Các protein được chuyển lên màng mà vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bản gel. Kết quả là protein sẽ được phơi ra trên lớp mỏng bề mặt để tiến hành xác định
Bước 4: Xử lý màng lai (Blocking)
Do kháng thể và protein đích đều là protein, nên thường thực hiện các bước để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể được sử dụng để xác định protein mục tiêu. Việc ngăn chặn các liên kết không đặc hiệu bằng cách đặt màng vào dung dịch protein loãng albumin huyết tương bò 3-5 % (BSA) hoặc sữa bột không béo trong Tris – Buffered saline (TBS). Protein trong dung dịch loãng sẽ gắn với màng ở tất cả các vị trí mà protein đích chưa gắn vào. Do đó khi kháng thể được bổ sung vào, sẽ không còn chỗ bám trên màng ngoại trừ các vị trí liên kết đặc hiệu với protein đích. Điều này làm giảm nhiễu cơ bản trong sản phẩm cuối cùng của Western Blot, cho kết quả rõ ràng và ngoại trừ hiện tượng dương tính giả.
Bước 5: Quá trình lai và phát hiện vị trí lai
Để phát hiện các protein chuyên biệt, màng được dò protein quan tâm bằng kháng thể đã biến đổi có khả năng liên kết với enzyme thông báo, enzyme này khi kết hợp với một cơ chất tương ứng sẽ thúc đẩy phản ứng hấp thụ quang và tạo màu. Quá trình này diễn ra gồm 2 bước:
- Màng lai đã cố định protein được lai với kháng thể sơ cấp. Kháng thể sơ cấp là một kháng thể đặc hiệu được tao ra khi cho vật chủ hay môi trường nuôi cấy tế bào miễn dịch tiếp xúc với protein quan tâm.
- Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp chưa liên kết, màng tiếp tục gắn kháng thể thứ hai (kháng thể thứ cấp) có gắn enzyme (thường sử dụng horseradish peroxidase). Tiếp tục ủ màng lai trong một hỗn hợp phản ứng đặc hiệu với enzyme. Đặt 1 tấm phim ngạy cảm với tia X lên màng lai để phát hiện các điểm sáng phát ra do enzyme.
Có thể sử dụng nhiều phương pháp để phát hiện kháng thể thứ cấp: sử dụng bức xạ hồng ngoại gần liên kết với kháng thể gắn chất huỳnh quang, sử dụng đánh dấu phóng xạ
3. Ứng dụng:
- Xác định sự hoạt động của gel thông qua sự có mặt của protein trong mô
- Nhận dạng protein mục tiêu
- Đánh giá tính chuyên biệt của kháng thể
- Phân tích bệnh do vi khuẩn và virus gây ra: thử nghiệm khẳng định HIV, viêm gan B
- xét nghiệm chẩn đoán chính xác các bệnh ký sinh trùng trên người.