Nguyên tắc của phương PCR
- Sợi khuôn DNA chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide.
- Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp DNA. Là tín hiệu chỉ hướng đi (5’ → 3’) của enzyme DNA-polymerase. Mồi dài khoảng 20 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp với nhau theo nguyên tắc bổ sung.
- Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP.
- Môi trường đệm cung cấp ion Mg và nước tinh khiết không có enzyme RNase và DNase.
- Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq)
Dung tích tổng số cho một phản ứng PCR khoảng từ 20 µl đến 50µl.
Đặc điểm của phản ứng PCR là chọn lọc, nhậy và nhanh
Các giai đoạn trong phản ứng PCR
Giai đoạn 1 - Biến tính DNA bằng nhiệt (denaturation)
Đưa DNA vào dung dịch phản ứng, tăng nhiệt độ của dung dịch lên tới 90÷98°C, thời gian lưu tương ứng khoảng từ 30s÷1 phút. Tại nhiệt độ này, các phân tử DNA mạch kép bị tách ra (do liên kết hydrô bị đứt), tạo nên các sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi mới.
Giai đoạn 2 - Thực hiện gắn mồi (primer anneraling)
Sau bước 1, nhiệt độ được hạ xuống từ từ và nhỏ hơn nhiệt độ Tm của mồi, vào khoảng 37÷68°C và thời gian lưu 30s÷1 phút. Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi khuôn. Mồi được tổng hợp hóa học, có mồi ngược và xuôi. Người ta còn có thể dựa vào trình tự nucleotide ở đầu 3’ của khuôn để tổng hợp mồi. Sau đó bổ sung DNA-polymerase để kéo dài mồi.
Giai đoạn 3 - Tổng hợp mạch mới hay còn gọi là kéo dài (extension)
Nâng nhiệt phản ứng lên (65°C-75°C) để phản ứng trùng hợp phân tử được thực hiện
Sản phẩm của PCR được kiểm tra bằng cách chạy điện di trên gel agarose nồng độ từ 0,8%÷2% để phát hiện sự đa hình của các đoạn DNA đặc thù, hoặc các đoạn DNA bị thay đổi do các tác nhân nào đó (đột biến, tái tổ hợp).
Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
- DNA mẫu làm khuôn
- Enzyme DNA-polymerase
- Mồi và nhiệt độ nóng chảy của mồ
- Các nuleotit
- Môi trường phản ứng
- Thời gian và số lượng chu kỳ
Ưu và nhược điểm của phương pháp PCR
Ưu điểm: Thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một trình tự đáng quan tâm. Thực hiện đơn giản và ít tốn kém (nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm thành phần tối thiểu được thực hiện đồng thời). Yêu cầu về độ tinh sạch của mẫu không cao (vết máu khô, mẫu vật khảo cổ, những vết tích để lại của người đã chết).
Nhược điểm: Cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại. Để có đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại. Kích thước DNA cần khuếch đại không vượt quá 3kb. Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác nhiều lần). Sai sót còn do sử dụng E-Taq-polymerase
Quá trình PCR
Quá trình PCR